Тар Ас (tap_ac) wrote,
Тар Ас
tap_ac

Category:

Вопрос закрыт они нас действительно метят.

Давно заметил что они о всём что собираются делать информируют людей заранее но у подавляющего большинства глаза есть а видеть нету.

Делал я нарезку по сериалу "Визитёры" и один из намёков который я особо выделил это о том что "Нас будут метить через ....." На тот момент я не мог это подтвердить но периодически искал что же такое субстанция R6 и наконец сегодня докопался до истины.

Ну и ещё хочу упомянуть церковь она же участница всего этого с её слитым планом оно же пророчество о начертании без которого .......

Сначала нашёл общую информацию:

Использование проникающих в клетки пептидов (СРР), таких как нона-аргинин (R9), ТАТ и пенетратин, в качестве векторов доставки для молекул, которые в противном случае не пересекают плазматическую мембрану, приобретает все большее значение в биомедицине ( Järver et al., 2010 ).

Ну и далее вишенка на торт, научная статья аж из 2013 года.

Эндоцитарный перенос наночастиц, доставляемых проникающими в клетки пептидами, состоящими из нона-аргинина и последовательности, ускоряющей проникновение.

Проникающие в клетки пептиды (CPP) могут проходить через клеточные мембраны и доставлять биологически активные молекулы в клетки. В этом исследовании мы демонстрируем, что CPP, состоящие из нона-аргинина (R9) и пептидной последовательности, ускоряющей проникновение (Pas), которая облегчает выход из эндоцитарных лизосом, обозначенных как PR9, значительно усиливают доставку нековалентно связанных квантовых точек (QD) в человека. А549 ячеек. Механистические исследования, анализ внутриклеточного трафика и анализ функциональных генов показывают, что эндоцитоз является основным путем внутриклеточной доставки комплексов PR9 / QD. Эндоцитарный перенос комплексов PR9 / QD контролировали с помощью конфокальной и просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). Анализ дзета-потенциала и размеров указывает на важность электростатических сил во взаимодействии комплексов PR9 / QD с плазматическими мембранами.

*

Транслокация трансактиватора транскрипционного (Tat) белка вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) в клетки зависит от последовательности, содержащей одиннадцать аминокислот (аминокислотная последовательность: YGRKKRRQRRR) . Используя эту последовательность, богатую основными аминокислотами, в качестве ориентира, было разработано множество небольших пептидов, которые обладают аналогичным потенциалом проникновения через мембрану . Эти пептиды, названные пептидами, проникающими в клетки (CPP), могут быть амфипатическими, гидрофобными или катионными . CPP могут способствовать доставке грузов, включая ДНК, РНК, белки и наночастицы, в живые клетки.

*

Квантовые точки (КТ) - это коллоидные неорганические наночастицы с уникальными химическими и физическими свойствами . Они являются отличной альтернативой флуоресцентным белкам из-за их высокой фотолюминесцентной квантовой эффективности, фотостабильности, настраиваемости, узкой спектральной полосы излучения и увеличенного времени жизни флуоресценции, и они широко используются в различных приложениях клеточной визуализации . Хотя КТ можно использовать для мониторинга клеточных процессов, они очень медленно проникают в клетки и захватываются эндосомами . Чтобы преодолеть эти ограничения, поверхностно модифицированные КТ ковалентными или нековалентными были введены связи с CPP (называемые CPP-QD или CPP / QD соответственно).

Цели этого исследования состояли в том, чтобы продемонстрировать опосредованную Pas нона-аргинином (PR9) клеточную интернализацию QD, выяснить клеточный механизм захвата и субклеточную локализацию комплексов PR9 / QD, идентифицировать молекулярные механизмы внутриклеточный транспорт комплексов PR9 / QD и идентифицируют физические свойства комплексов PR9 и PR9 / QD, которые влияют на захват. Для достижения этих целей мы синтезировали PR9 и исследовали пути трансдукции и внутриклеточное перемещение комплексов PR9 / QD с использованием проточной цитометрии и визуализации живых клеток. Чтобы идентифицировать клеточные механизмы поглощения комплексов PR9 и PR9 / QD, были использованы фармакологические и физические ингибиторы для блокирования определенных путей поглощения. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) использовалась для мониторинга прогресса эндоцитоза. Некоторые физические свойства комплексов PR9 и PR9 / QD были охарактеризованы с помощью анализа дзета-потенциала и спектроскопии кругового дихроизма (КД). Токсичность комплексов PR9 и PR9 / QD оценивали с помощью анализа восстановления красителя 1- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -3,5-дифенилформазан (МТТ). Это исследование обеспечивает ценную механистическую информацию о том, как PR9s способствуют ускользанию из эндоцитарных пузырьков, и обеспечивает основу для разработки оптимизированной доставки грузов в клетки.

*

Чтобы определить, может ли PR9 доставлять функциональные гены, клетки обрабатывали либо 3 мкг плазмидной ДНК pEGFP-N1 отдельно (контроль), либо плазмидной ДНК pEGFP-N1, смешанной с PR9 (27 нмоль) при азоте (NH 3 + ) / фосфате. (PO 4 - ) (N / P) соотношение 3 в среде RPMI 1640 с добавлением 1% сыворотки в течение от 30 мин до 24 ч при 37 ° C. Затем раствор удаляли и клетки трижды промывали PBS. К клеткам добавляли 100 мкл полной ростовой среды и инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов. Через два дня клетки окрашивали Hoechst 33342 и наблюдали с использованием системы биовизуализации BD Pathway 435.

*

Для исследования эффективности опосредованного PR9 транспорта квантовых точек в клетки был проведен временной эксперимент на человеческих клетках A549. КТ были предварительно смешаны с CPP SR9, HR9 или PR9 или без них в течение 2 часов, добавлены к клеткам на срок до 6 часов, а затем проанализированы с помощью проточной цитометрии. Через 1 час степень поглощения отображалась в следующем порядке: HR9 / QD> SR9 / QD> PR9 / QD ( рис. 1 ), и поглощение всех комплексов CPP / QD было практически полным к 4 часам. Различия в кинетике захвата могут отражать участие различных механизмов захвата.

Данные указывают на то, что комплексы PR9 / QD подвергаются эндоцитозу. Мы исследовали внутриклеточный трафик и судьбу комплексов в течение пяти часов, используя колокализацию сигнала флуоресцентных комплексов CPP / QD с маркерами, специфичными для органелл.

Клетки обрабатывали комплексами PR9 / QD в течение 30 минут, 1, 2, 3, 4 и 5 часов с последующим окрашиванием антителом против EEA1 человека, LysoTracker DND-99 и Hoechst 33342. Комплексы CPP / QD и ранние эндосомы показали ограниченная совместная локализация на 30 мин, и совместная локализация постепенно увеличивалась от 1 до 5 ч. Рисунок 4B показывает, что комплексы PR9 / QD проникают в лизосомы, и большинство комплексов захватываются лизосомами через 2–3 часа (см. Вставки 1, 2, 3 через 2–3 часа). . Частично перекрывающиеся изображения между комплексами PR9 / QD и лизосомами были получены после более длительных обработок, что свидетельствует об уходе комплексов PR9 / QD из кислых пузырьков. Высокая интенсивность зеленой флуоресценции была отмечена на периферии ядра после более длительной инкубации, что указывает на накопление комплексов PR9 / QD в этой области (канал GFP через 5 часов на рисунке 4B и через 4 часа на рисунке 4C ). Интенсивность совместной локализации комплексов PR9 / QD и лизосом была максимальной после 2-часовой инкубации, а затем начала снижаться, что указывает на выход из лизосом.

*

В этом исследовании мы демонстрируем, что классический энергозависимый эндоцитоз является основным путем клеточной интернализации комплексов PR9 / QD, и что хлорохин оказывает лизосомотропный эффект на комплексы PR9 / QD, позволяя им выходить из эндоцитарных пузырьков в цитоплазму. Комплексы PR9 / QD колокализуются с актинами, лизосомами, ранними эндосомами и ядром. ПЭМ-анализ выявил эндоцитарный перенос комплексов PR9 / QD в клетки.

СРР-трансдукция QD в стволовые клетки с высокой эффективностью трансдукции и низкой цитотоксичностью была продемонстрирована.

*

Этот результат согласуется с нашей более ранней демонстрацией, что комплексы HR9 / QD проникают в клетки путем прямой транслокации мембран. Напротив, эндоцитоз, по-видимому, является основным путем внутриклеточной доставки комплексов PR9 / QD и SR9 / QD. Однако комплексы SR9 / QD проникают в клетки несколькими путями. Среди них макропиноцитоз, форма эндоцитоза, зависящая от липидного рафта, является важным путем проникновения SR9 / QD.

Выводы

Комплексы PR9 / QD, состоящие из проникающего в клетку пептида (нона-аргинин; R9) и последовательности, ускоряющей проникновение пептида (Pas), которая способствует выходу из лизосом, нековалентно образующих комплекс с зондом квантовой точки (QD), оценивали как систему клеточной трансдукции. Гистологические результаты показывают, что эндоцитоз является основным путем клеточного поглощения комплексов PR9 / QD. Комплексы PR9 / QD первоначально колокализуются с актинами, лизосомами и ранними эндосомами, а затем с ядром. Плазмидная ДНК, доставленная PR9, экспрессировалась клетками. Анализ дзета-потенциала показал важность электростатических взаимодействий комплексов PR9 / QD с плазматическими мембранами. Комплексы PR9 / QD не были токсичными для клеток. Таким образом, PR9 может быть эффективным и безопасным вектором доставки для биомедицинских приложений.

Лю Б.Р., Ло С.И., Лю С.К., Чиан С.Л., Хуанг Ю.В., Аронстам Р.С. и др. (2013) Эндоцитарный перенос наночастиц, доставляемых проникающими в клетки пептидами, состоящими из нона-аргинина и последовательности, ускоряющей проникновение. PLoS ONE 8 (6): e67100. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067100

Поступила: 28 февраля 2013 г .; Принята в печать: 15 мая 2013 г .; Опубликовано: 26 июня 2013 г.
P/S
В сериале R6 но вам никто совсем в открытую информацию давать не будет принцип один и тот же:

Цитозольное проникновение зависит от количества присутствующих остатков аргинина.

Была синтезирована серия пептидов dfRn, где n = 4,5,6 или 7. Пептид dfR4, наименьшее соединение серии, не обнаруживает детектируемого проникновения в клетки, независимо от тестируемой концентрации (от 1 до 5 мкМ). Вместо этого пептид, по-видимому, накапливается исключительно внутри эндосом, на что указывает совместная локализация с лизотрекером Green, флуорофором, который окрашивает подкисленные эндоцитарные органеллы . Активность dfR5 была столь же низкой. Напротив, как dfR6, так и dfR7, подобно dfTAT и dfR8, демонстрировали устойчивое цитозольное проникновение и окрашивание ядрышка.
***
Таким образом, мы пришли к выводу, что лучший подход - это модифицировать существующие CPP для поиска пептидов, которые могут иметь повышенную внутреннюю эндосомолитическую активность. Были приняты две векторные стратегии, обе учитывающие ключевую роль, которую играют боковые цепи Arg в захвате CPP. Недавно мы показали, что конъюгат (R-Ahx-R) 4 –PMO705 обладает значительной активностью по коррекции сплайсинга на модели повышающей регуляции люциферазы при концентрации 1 мкМ в отсутствие эндосомолитического агента. Аналогичным образом мы показали, что конъюгат (R-Ahx-R) 4 -PNA705 также обладал значительной корректирующей активностью при сплайсинге при концентрации 1 мкМ. В параллельных исследованиях мы обнаружили значительную активность трансгенных вирусов ВИЧ-1.- анализ ингибирования активации (также требующий ядерной доставки), когда производное известного CPP пенетратина, в котором шесть остатков Arg были добавлены к N-концу CPP, R6- пенетратин (R6Pen), было конъюгировано с дисульфидом с PNA комплементарен РНК элемента, отвечающего за трансактивацию. Мы показываем, что этот модифицированный Arg CPP при конъюгировании с PNA, нацеленной на сайт коррекции сплайсинга люциферазы, демонстрирует на сегодняшний день самый высокий уровень регуляции люциферазы как на уровне белка, так и на уровне РНК при концентрации 1 мкМ по сравнению со всеми предыдущими изученными CPP.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Конъюгат R6Pen и, в меньшей степени, конъюгат (R-Ahx-R) 4, вызывали сильную повышающую регуляцию люциферазы в условиях, когда конъюгаты пептидов K8 и Tat были по существу неактивными. Таким образом, R6Pen оказывается значительно более эффективным в качестве CPP и приводит к гораздо более сильной коррекции сплайсинга по сравнению с ранее использованным нами (R-Ahx-R) 4-PNA705.

Subscribe

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

  • 73 comments
Previous
← Ctrl ← Alt
Next
Ctrl → Alt →
Previous
← Ctrl ← Alt
Next
Ctrl → Alt →